Micromilli - 生物技术资讯

1. dNTP终浓度200μM足矣，过高（>4mM）会对扩增反应产生抑制。一般，dNTP产品包装的浓度是10mM（dATP、dCTP、dTTP、dGTP各2.5mM），因此，50μL的反应体系中加入1ul dNTP即可。

2. 扩增体系中模板的量不宜过多，否则可能会出现目的条带弥散模糊。

3. Mg离子浓度过高会导致非特异性扩增，过低又会使聚合酶无法与模板结合。最优的Mg离子浓度需要摸索，不过，按照你自己的习惯和经验来就可以了。

Mg离子的作用：

Mg与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别

注意事项：
镁离子的浓度取决于dNTP、PPi、EDTA等这些带负电荷的可以与Mg结合的物质的浓 度。所以镁离子的浓度一定要比这些物质的浓度高才可以。最适合的浓度应该是通过试验摸索获得的，基本上它应该介于1 mM到5 mM之间。最常用的比例是MgCl2浓度1.5 mM，每种dNTP浓度0.2 mM。过量的镁离子可能会引发非特异的复制起始，而量不足则容易会造成产率过低。

关于dNTP的浓度需要注意：
保证4种dNTP的浓度是一样的，降低引入突变的机率。每种dNTP的终浓度应该在0.05到0.5 mM之间，最常用的是0.2 mM。如果要提高dNTP的浓度，也要相应提高镁离子的浓度，否则造成自由镁离子浓度偏低，影响聚合酶的活性。