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无细胞体系中的蛋白质合成

摘要：
    最近几年无细胞的蛋白质表达系统再次受到关注，因为无细胞系统有其优点。例如，可改变反应条件以利于蛋白质折叠；对有毒表达产物的灵敏性降低；可减小反应体积，缩短反应时间，适合于高通量表达。而且通过改善翻译效率可使每毫升反应混合物中目标蛋白质的产率可达到毫克水平。总之，在无细胞系统合成蛋白质可促进蛋白质组学的研究。

Nirenberg和Matthaei在45年前开创了蛋白质的无细胞合成。这方法对了解mRNA如何翻译为功能性蛋白质，作出了重要贡献。此外，这方法也被用于开发新抗菌素类药物和具有细胞毒性的小规模表达。然而，由于此方法的表达量有限，无法进行规模生产，因此，在过去几十年中受到冷落。

自从蛋白质组学的兴起，蛋白质合成的无细胞系统又开始复苏。蛋白质组学的研究需要进行高通量的蛋白质表达，体积无需很大，表达量不必很多，但是要快速，表达的蛋白质可以被翻译后加工。而这几个方面却是无细胞系统表达蛋白质的专长。为了能使蛋白质的无细胞表达更有成效，在方法和技术上也需所改进和发展。在方法改善的同时，其应用也日益拓展。

1.    蛋白质无细胞表达系统简介

随着对蛋白质生物合成机制的揭示，人们完全能够接受蛋白质合成的无细胞系统，因为蛋白质生物合成的机器是核糖体，如果存在有tRNA，以及必要的酶和各种因子，只要提供外援的RNA模版、氨基酸和能量，无需其他的细胞组分（包括细胞核），蛋白质也能顺利地合成。也就是说，转录和翻译是可以彼此独立，不需偶合。而在各种细胞的裂解液中几乎都含有蛋白质生物合成所需的核糖体以及各种酶和因子。

1.1.  裂解液的来源

理论上，所有的细胞都可以用作蛋白质的无细胞表达体系，但是，最常用的却只有三种：大肠杆菌、麦胚和兔网质红细胞。以大肠杆菌为基础的无细胞体系，可提供更高的表达量，表达产物相对更均一，适合于结构研究。麦胚和兔网质红细胞则是真核体系，产出较低，但是可进行翻译和加工，为此得到产物可用于蛋白质的功能研究。由麦胚和兔网质红细胞得到无细胞表达体系。两者相比，后者的表达量仅微克级，而麦胚体系可高出约2个数量级。

除了粗的细胞裂解液外，也可以通过重组的方法得到蛋白质的无细胞表达体系，即人为地将大肠杆菌中有关的百余种纯化的蛋白质混合。

尽管这样得到的重组体系翻译效率更高、操作简单，产物易于纯化，但是前期的各种组分的制备却是复杂和麻烦的。其实用性受人置疑。

1.2.  操作过程

传统的操作是所谓分批（batch）法，即将反应液和供应体系混合在一起，见图1a。这样的过程仅能维持在一小时以内，因为能量快速的使用殆尽，生产的游离磷酸又和镁离子结合，导致蛋白质生物合成的抑制。一种改进的方法是连续流动法，即不断地添加能量和底物，同时除去反应的副产物，如图1b所示。这一方法可以持续20小时，产率也可提高2个数量级，但是操作复杂，不实用。另一种方法则是连续交换法，用膜将反应液和供应体系隔开（图1c），此法可以高通量，同时微量化和自动化。图1d介绍的方法是用高效的双层扩散系统替代膜。如果结合了能量再生系统，产率可以接近每毫升一毫克目标蛋白质。

             

 

                 图1  无细胞系统表达蛋白质的不同操作模式

 

2.    蛋白质无细胞表达系统的关键问题

新生肽链变成活性蛋白质的关键是肽链的折叠和与活性有关的某些翻译后加工。虽然无细胞体系中没有内质网等与蛋白质折叠和翻译后加工的细胞器，但是，可以人为地向无细胞体系中加入各种蛋白质和/或试剂促进蛋白质的折叠和后加工。

2.1.无细胞系统中的蛋白质折叠

首先，加入各种分子伴侣可以促进新生肽链的折叠，然而，分子伴侣的作用明显地具有特异性。例如，常见的DnaK、DnaJ、GroEL和GroES等可以有益于抗体的Fab的合成，但是对荧光素酶的折叠和活性没有效果。

膜蛋白占基因组编码的蛋白质中的1/3，而经结构测定的膜蛋白还没有超过一百种。膜蛋白研究瓶颈是在细胞内膜蛋白不能高表达，因为膜蛋白具有较强的疏水性，易聚集和发生错折叠，而为折叠的膜蛋白肽链有对细胞有毒性。有些膜蛋白（例如离子通道、膜转运体等）对细胞的毒性还表现在整合到质膜上，明显地改变了膜的特性，导致膜的破裂，细胞的死亡。但是，在无细胞表达体系中可以加入天然的和合成的脂质、或温和的去垢剂，将防止聚集或错折叠，然而，又不影响翻译过程。此外，还可通过有关配体的共表达，帮助膜蛋白的折叠，提高膜蛋白的溶解度。甚至可有利于膜蛋白的究竟结晶。目前，已经可以用无细胞表达体系得到毫克量的膜蛋白—多药转运体。

很多蛋白质含有二硫键，而无细胞系统中的还原性环境是不利于二硫键的形成，但是加入二硫键异构酶和适当的谷胱甘肽氧化还原缓冲液，对形成正确的二硫键是有积极作用的。

2.2.无细胞体系中的蛋白质翻译后加工

在所有的蛋白质翻译后加工中，糖基化是最广泛的。而糖基化的酶系是存在于内质网和高尔基体中，为了能使无细胞体系的表达产物能糖基化有两种方法。一是向无细胞体系中加入含有内质网的微粒体系统。二是，在合成过程中，在肽链中引入单糖修饰的氨基酸（目前已有相应的技术），然后，在此单糖上继续接上其他单糖，是糖链延伸。

其他的多种修饰，例如磷酸化、豆蔻酰化、异戊二烯化，也可以使用不同的高等真核细胞的体系加以实施。

3.      蛋白质无细胞表达系统的应用

利用无细胞体系表达蛋白质已经应用于很多方面，但是大致可以归属于以下三个方面。

3.1.结构蛋白质组研究中的应用

首先，利用无细胞体系可以进行蛋白质的高通量表达，能同时得到许多用于结晶的蛋白质，进而开展结构蛋白质组的研究。第二，特别是膜蛋白和有细胞毒性的蛋白质都可以利用无细胞体系进行表达。第三，可以在蛋白质中人为地引入硒代半胱氨酸，有利于蛋白质的X射线结晶学研究。第四，因为可以在很小体积内进行无细胞体系的蛋白质表达，这样有利于蛋白质的同位素标记，例如进行了双重同位素标记

蛋白质后，无需复杂的纯化，即可以进行灵敏的NMR异核谱测定。

3.2.功能蛋白质组研究中的应用

同样是因为无细胞体系可以进行蛋白质高通量、微化的表达，表达后又可省去系统地分离纯化，因此对表达产物的活性测定非常容易，尤其是对酶的活性研究。

如果进一步降低无细胞表达体系的体积，使得反应浓集在很小区域内（例如在96孔板中），几乎可以达到蛋白质（微）阵列的目的。

在无细胞体系表达蛋白质时可以引入非天然氨基酸（其中包括荧光和生物素光标记的氨基酸、可以进行光化反应的修饰氨基酸），对蛋白质进行修饰和标记。这样可以更为有效地研究蛋白质组中得到的各个组分的功能。

在无细胞体系表达蛋白质的过程中，如果使用的mRNA是没有终止密码，其结果是核糖体不能和mRNA分离，导致翻译过程的熄火，同时存在了RNA-核糖体-蛋白质三元复合物。因此，可以利用这样的方法将蛋白质展示在核糖体表面，其效果可以与其他的蛋白质展示技术相比。  

3.3.诊断

在进行基因诊断中聚合酶链式反应（PCR）被广泛使用。如果将PCR得到产物用于无细胞体系进行蛋白质片段的表达，然后，用SDS-PAGE和/或ELISA测定表达产物。这样就可以快速将基因诊断和蛋白质诊断相结合

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转自：上海行业科技情报（http://www.istis.sh.cn/hykjqb/wenzhang/list_n.asp?id=2335&sid=2）