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1. dNTP终浓度200μM足矣，过高（>4mM）会对扩增反应产生抑制。一般，dNTP产品包装的浓度是10mM（dATP、dCTP、dTTP、dGTP各2.5mM），因此，50μL的反应体系中加入1ul dNTP即可。

2. 扩增体系中模板的量不宜过多，否则可能会出现目的条带弥散模糊。

3. Mg离子浓度过高会导致非特异性扩增，过低又会使聚合酶无法与模板结合。最优的Mg离子浓度需要摸索，不过，按照你自己的习惯和经验来就可以了。

Mg离子的作用：

Mg与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别

注意事项：
镁离子的浓度取决于dNTP、PPi、EDTA等这些带负电荷的可以与Mg结合的物质的浓 度。所以镁离子的浓度一定要比这些物质的浓度高才可以。最适合的浓度应该是通过试验摸索获得的，基本上它应该介于1 mM到5 mM之间。最常用的比例是MgCl2浓度1.5 mM，每种dNTP浓度0.2 mM。过量的镁离子可能会引发非特异的复制起始，而量不足则容易会造成产率过低。

一、按照引物的OD数计算
    1. 引物溶解前先在离心机上离心片刻以防止粉末散失。
    2. 将引物浓度调整到50μmol/l （即50pmol/μl ）所需加入的双蒸水：
    dH20（μl）＝（OD×33/M.W.）×20000
    调整到20μmol/l所需加入的双蒸水：dH20（μl）＝（OD×33/M.W.）×20000×2.5

二、按照引物的摩尔数计算
如果知道引物的摩尔数，则溶解时按照如下公式计算：
需加水量（ul）＝（引物nmole数× 1000）/ 期望浓度uM

上游（5'-）引物：
引物序列与反义链相同，以正义链为模板进行反方向扩增，注意最终递交的引物（含扩展序列）方向应该要颠倒为5'->3'方向 （即采用了正义链的反向互补序列）

下游（3'-）引物：
引物序列与正义链相同，以反义链为模板进行正方向扩增。

凡经过体外DNA 重组以后, 都要通过挑取重组子克隆的方法将改变以后的DNA 序列固定下来。